Границы | Кожная слизь дорады морского леща (Sparus aurata L.). Картирование и регуляция белков у рыб с хронической нагрузкой | физиология

1. Вступление Кератинизированный многослойный клеточный слой (stratum corneum) покрывает эпидермис взрослых...
2. Одномерный электрофорез
3. Двумерный электрофорез
4. Масс-спектрометрии
5. Вестерн-блот
6. Статистический анализ
7. Результаты и обсуждение
8. Характеристика белка и функции
9. Белки, регулируемые стрессом
10. Выводы
11. Вклад автора
12. финансирование
13. Заявление о конфликте интересов
14. Дополнительный материал

Вступление

Кератинизированный многослойный клеточный слой (stratum corneum) покрывает эпидермис взрослых амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих, тогда как слизь кожи представляет собой самый внешний эпидермальный барьер у личинок рыб и водных амфибий ( Шемпп и др., 2009 ). Таким образом, кожная или кожная слизь считается метаболически активной тканью, играющей важную роль в дыхании, ионной и осмотической регуляции, экскреции, передвижении, общении, сенсорном восприятии, терморегуляции и иммунологической защите ( Негус, 1963 ; Шефард, 1994 ; Конус, 2009 ; Эстебан, 2012 ). Несколько типов клеток участвуют в регулировании состава слоя слизи кожи, хотя в основном он формируется клетками Кубка, которые выделяют слизистые гранулы, содержащие гликопротеины с высокой молекулярной массой, называемые муцинами ( Дхармани и др., 2009 ). Эти O-гликозилированные гликопротеины присутствуют на вершине всех эпителиев с мокрой поверхностью с четко выраженным паттерном экспрессии, который может быть нарушен в ответ на широкий спектр повреждений или проблем. Например, недавние эксперименты с дрейфующим морским лещом ( Sparus aurata L.) показывают, что характер генной экспрессии муцинов кишечника изменяется с помощью пищевых масел и паразитарного энтерита ( Перес-Санчес и др., 2013b ). Помимо гликопротеинов, в слизи различных видов рыб были обнаружены гликозаминогликаны, иммуноглобулины, лектины, феромоны и протеолитические ферменты ( Флетчер и Грант, 1969 ; Хьелмеланд и др., 1983 ; Ван де Винкель и др., 1986 ; Shiomi et al., 1988 ; Шефард, 1994 ; Субраманян и др., 2008 ; Гвардиола и др., 2014 ; Рен и др., 2015 ). Большинство этих молекул участвуют в врожденном иммунитете рыб, и слизь кожи считается ключевым компонентом иммунных реакций рыб ( Эллис, 2001 ; Салинас и др., 2011 ; Эстебан, 2012 ). Это, безусловно, является результатом эволюционной адаптации рыб к выживанию в различных водных средах, богатых патогенными организмами. Тем не менее, иммунный ответ может быть истощен стрессовыми условиями, такими как вызванные высокой плотностью или неподходящим аквакультурным хозяйством. Таким образом, ограничение стресса в настоящее время считается ключевым вопросом для снижения экономических потерь из-за условно патогенных микроорганизмов в интенсивном рыбоводстве ( Манкузо, 2012 ).

У костистых рыб стресс активирует гипоталамус-гипофиз-межпочечниковую ось, приводя к быстрому высвобождению глюкокортикоидного гормона кортизола из межпочечной ткани, ткани, аналогичной коре надпочечников млекопитающих ( Поттингер, 2008 ; Панкхерст, 2011 ). Таким образом, высокий уровень кортизола в крови обычно используется в качестве индикаторов острого стресса у рыб, хотя нет единого мнения об эндокринном профиле у животных с хроническим стрессом или о том, как его оценить, не вызывая дальнейшего стресса ( Панкхерст, 2011 ; Диккенс и Ромеро, 2013 ). Это понятие относится к морскому лещу, подверженному хроническому и острому стрессу ( Арендс и др., 1999 ; Rotllant et al., 2000 ; Calduch-Giner и др., 2010 ; Фанураки и др., 2011 ), даже в более высоком смысле, когда рассматриваются периодические и повторяющиеся стрессоры ( Торт и др., 2001 ; Ибарц и др., 2007 ). Следовательно, профилирование экспрессии генов, чувствительных к стрессу, в различных тканях-мишенях рассматривается как дополнительный инструмент для оценки пищевого и экологического стресса у рыб ( Терова и др., 2005 , 2009 ; Римольди и др., 2012 , 2016 ; Монтеро и др., 2015а , б и морского леща в частности ( Перес-Санчес и др., 2013a ; Бенедито-Палос и др., 2014 ; Бермехо-Ногалес и др., 2014 ). Однако такой подход часто требует принесения в жертву образцов, и более целесообразно использование биологического образца, полученного минимально инвазивным способом. Кожная слизь соответствует этим требованиям, особенно с учетом того, что одним из наиболее очевидных ответов рыб на стресс является образование обильного количества слизи кожи ( Ватсос и др., 2010 ). Таким образом, стресс, связанный с живым транспортом, увеличил выработку сульфатированных и сиалированных кожных муцинов у канала сома ( Такчи и др., 2015 ). Ай-Джун и соавт. (2013) идентифицировал лектины и цитокератины кожной слизи как биоиндикаторы теплового стресса у тюрбо. Заражение морскими вшами увеличило содержание лектинов в слизи кожи атлантического лосося ( Легко и Росс, 2009 ), в то время как транскрипционный и протеомный подходы выявили дифференциально экспрессируемые белки в слизи кожи атлантической трески при естественной инфекции Vibrio anguillarum ( Раджан и др., 2013 ). Аналогичным образом, профилирование метаболитов слизи кожи рыб было успешно применено в качестве нового подхода для мониторинга и наблюдения за здоровьем диких рыб ( Экман и др., 2015 ; Джул-Каамаль и др., 2016 ).

В последнее время также были предприняты важные исследования в области картирования протеома кожной слизи морской рыбы, обитающей в теплой воде, такой как морской лещ Хурадо и др., 2015 ; Санахуя и Ибарз, 2015 ; Кордеро и др., 2016 ) и европейский морской окунь ( Кордеро и др., 2015 ), которые являются двумя наиболее важными видами в средиземноморской аквакультуре. Эти исследования сделали важные достижения в определении состава слизи рыб, а также подчеркнули, что пробиотики и переполненный стресс вызывают протеомные изменения, в основном связанные с иммунными процессами. Однако до сих пор очень мало известно о воздействии других типов стрессоров, которые тесно связаны с повседневной сельскохозяйственной деятельностью, таких как люди, идущие рядом с резервуарами, удаление мертвой рыбы, а также изменения уровня шума и / или освещенности, которые потенциально провоцируют широкий спектр стимулов, которые трудно оценить неинвазивным и простым способом ( Братланд и др., 2010 ; Нильссон и др., 2012 ). Таким образом, цель настоящего исследования состояла в том, чтобы получить новое понимание состава слизи морского леща-дрозда, способствующего выявлению устойчивых и неинвазивных биомаркеров в модели хронического стресса в повседневной сельскохозяйственной деятельности, которая ранее была охарактеризована с помощью более общепринятые стресс-биомаркеры производительности рыб на уровне гормональной и печеночной транскрипции ( Бермехо-Ногалес и др., 2014 ). Чтобы решить эту проблему, были объединены одномерные и двумерные протеомные подходы, сопровождаемые масс-спектрометрией, с использованием базы данных гомологичных белков, полученной из транскриптома морского леща IATS-CSIC ( Calduch-Giner и др., 2013 ) для последовательных и надежных белковых совпадений.

Материалы и методы

Коллекция животных и слизи

Двухлетний дорада морского леща (средняя масса тела 320 г) из исследования Бермехо-Ногалес и др. (2014) состояла из контрольной группы без стресса (CTRL) и группы рыб, подвергшихся воздействию модели хронического стресса, которая состояла из быстрой серии автоматических стрессоров (многократная сенсорная стрессовая рыба, M-ST): сотрясение аквариума, звуки, перемещение объектов в воду, обратный поток воды и вспышки света в случайном порядке в течение 30 минут три раза в день (9:30, 14:30 и 18:30) в течение 21 дня. В конце экспериментального периода восемь рыб в каждой группе были случайно отобраны и анестезированы 100 мг / л MS-222 (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США). Слизь осторожно соскребали с нормальной поверхности кожи с левой стороны рыбы от жаберной кости до хвоста с помощью стерильных микропрепаратов, избегая сбора крови, мочи и кала вместе со слизью. Затем слизь кожи переносили в пробирки Эппендорфа и сразу же замораживали при -80 ° C до анализа. Все процедуры выполнялись в перчатках, чтобы избежать загрязнения человека, и в соответствии с норвежским национальным советом по этике для экспериментов с животными (ID № 4007) и законодательством ЕС (2010/63 / EU) по обращению с экспериментальными животными.

Одномерный электрофорез

Белковый состав слизи сначала анализировали с помощью одномерного электрофореза (1-DE). Первоначально образцы слизи от всех животных (рыбы CTRL и M-ST) объединяли, а образцы в трех экземплярах (54-56 мкг) разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) с использованием предварительно приготовленного геля TGX Any kD (Bio -Rad, Hercules, CA, USA) работает при 200 В в течение 25 мин и окрашивается в течение ночи коллоидным кумасси (Bio-Rad). Затем гель разделяли на 10 срезов (0,65 см), которые анализировали независимо. Белки в геле расщепляли трипсином белкового качества (Promega, Madison, WI, USA) и концентрировали в вакууме при скорости до конечного объема 12 мкл для масс-спектрометрии.

Двумерный электрофорез

Отдельные образцы рыбы CTRL и M-ST ( n = 8 для каждой группы) осаждали с помощью набора для 2-D очистки (GE HealthCare Life Sciences, Бакингемшир, Великобритания), а затем растворяли в буфере для метки (7 М). мочевина, 2 М тиомочевина, 4% мас. / об. ХАПС, 20 мМ Трис). Красители на основе N-гидроксисукцинимидного эфира Cy2 / 3/5 были использованы для минимальной маркировки в соответствии с методологией смешанного внутреннего стандарта. Alban et al. (2003) в соответствии с протоколом производителя (GE HealthCare Life Sciences). Вкратце, 50 мкг каждого экспериментального образца были индивидуально помечены 400 пмоль либо Cy3, либо Cy5. Параллельно был создан смешанный внутренний стандарт путем объединения равных количеств каждого экспериментального образца, которые затем были помечены 400 пмоль Cy2. Мечение проводили в течение 60 минут на льду в темноте, после чего реакцию гасили добавлением 10 нМ лизина в течение 10 минут.

Около 150 мкг белка (инкубированного в 65 мМ DTT и 1% амфолитах) загружали в Immobiline DryStrips (pH 3-11, 24 см), регидратировали в течение ночи в 8 М мочевине, 4% мас. / Об. CHAPS, 12 мкл / мл. Реагент DeStreak, 1% амфолит. После фокусировки при 32 кВч при 20 ° С полоски сначала уравновешивали в течение 15 мин в восстановительном растворе (6 М мочевина, 50 мМ Трис-HCl, 30% об. / Об. Глицерина, 2% об. / Об. SDS, 2% об. / Об. DTT) и затем в алкилирующем растворе (6 М мочевина, 50 мМ Трис-HCl, 30% об. / Об. Глицерина, 2% об. / Об. SDS, 2,5% об. / Об. Иодацетамида) в течение 15 мин. Второе измерение (12,5% полиакриламид, 25 × 21 см) проводили при 20 ° C при постоянной мощности 2 Вт в течение 60 минут, а затем 15 Вт до тех пор, пока фронт отслеживания бромфенолового синего не покинул конец геля (6 часов). ). Флуоресцентные изображения были получены на сканере Typhoon 9 400 (GE HealthCare Life Sciences). Изображения Cy2, Cy3 и Cy5 сканировались при длинах волн возбуждения / испускания 488/520 нм, 532/580 нм и 633/670 нм соответственно с разрешением 100 мкм. Анализ изображений проводили с использованием программного обеспечения DeCyder v.6.5 (GE HealthCare Life Sciences). Белковые пятна, демонстрирующие статистически значимое различие между группами, вырезали вручную из аналитических гелей и расщепляли трипсином чистоты секвенирования перед масс-спектрометрическим анализом.

Масс-спектрометрии

Образцы (5 мкл) из 1-DE и двумерного электрофореза (2-DE) анализировали с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения (LC-HRMS) с использованием квадрупольного масс-анализатора времени пролета (qQTOF). Вкратце, образцы загружали в улавливающую колонку (NanoLC Column, 3 мкМ C18-CL, 350 мкм × 0,5 мм, Nikkyo Technos Co. Ltd., Токио, Япония), обессоленные 0,1% TFA при 3 мкл / мин в течение 10 минут. Затем пептидные смеси загружали в аналитическую колонку (колонка LC, 3 мкМ C18-CL, 75 мкм × 12 см, Nikkyo Technos Co. Ltd.), уравновешенная в 5% ацетонитриле и 0,1% муравьиной кислоте. Разделение проводилось с линейным градиентом 5–40% градиента ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислотой при скорости потока 300 нл / мин. Пептиды анализировали в масс-спектрометре nanoESI (qQ) TOF высокого разрешения (система AB SCIEX TripleTOF 5600, Applied Biosystems / MDS Sciex, Foster City, CA). (QQ) TOF работал в режиме сбора информации, в котором выполнялось сканирование MS TOF в течение 0,25 с от 350 до 1250 м / з, с последующим сканированием ионов-продуктов с 0,05 с от 100 до 1500 м / з. 50 наиболее интенсивно 2–5 заряженных ионов. Данные протеомики MS были переданы в Консорциум ProteomeXchange через репозиторий партнера PRIDE с идентификаторами набора данных PXD004115 и PXD004116.

Идентичность белка определяли с использованием ProteinPilot v4.5 (AB SCIEX, Applied Biosystems / MDS Sciex), который включал алгоритм поиска талисмана (v2.2, Matrix Science, Лондон, Великобритания). Параметры по умолчанию ProteinPilot использовались для создания списка пиков непосредственно из 5600 файлов TripleTOF wiff. Талисман использовался для поиска в базе данных белков Expasy или в базе данных морского леща IATS-CSIC ( www.nutrigroup-iats.org/seabreamdb ) в соответствии со следующими параметрами: специфичность трипсина, карбамидометил С для модификации модификации, дезамидированный (NQ), Gln-> пиро-Glu (N-член Q), Glu-> пиро-Glu (N-член E), окисление (M ) до вариабельной модификации, 75 ч / млн как толерантность к массе пептида и 0,6 Да как толерантность к массе фрагмента. Белки с баллом ProteinPilot выше 1,3 были идентифицированы с доверительным интервалом ≥95%. Функциональный анализ идентифицированных белков был выполнен с помощью программного обеспечения Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ( www.ingenuity.com ). Для каждого белка в анализе проводили поиск эквивалента присоединения Uniprot для одного из трех видов моделей высших позвоночных в IPA (человек, крыса или мышь), как сообщалось ранее для кодирующих транскриптом белков белка морского леща дрозда ( Calduch-Giner и др., 2013 ).

Вестерн-блот

Чтобы подтвердить результаты анализа 2-DE, повышенное содержание цитоскелета 8 кератина типа II в M-ST по сравнению с группой CTRL оценивали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела, направленного на цитокератин 8 человека. Общая концентрация белка из образцов слизи CTRL и M-ST рыбы определяли с использованием анализа белка Брэдфорда (Bio-Rad). Анализируемый количественно анализируемый белок оставался почти одинаковым в обеих экспериментальных группах (1 мкг / мкл), и равные количества из двух разных групп смешивали с буфером для образцов 2 × SDS (1,5 М Трис, рН 8,8, 0,2% глицерина, 0,4% SDS, 0,1 % 2-меркаптоэтанол и 0,05% бромфеноловый синий), нагревали в течение 5 минут при 50 ° C и разделяли с помощью SDS-PAGE. После электрофореза белки переносили на поливинилидендифторидные (PVDF) мембраны (Invitrogen, Gaithersburg, MD, USA) при 15 В в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем мембраны блокировали в 5% обезжиренном сухом молоке, приготовленном в TBS (20 мм трис, рН 7,5, 500 мМ NaCl) в течение ночи при 4 ° С. После блокирования мембраны инкубировали с кроличьим антителом против человеческого цитокератина 8 (PA5-29607, Thermo Scientific, Wilgminton, DE, USA) в буфере для антител (0,1% Tween 20, 1% бычий сывороточный альбумин), используя разведение 1: 2000 от поставляемой концентрации антител. Пептидный иммуноген (длиной 252 аминокислоты) этого первичного антитела имел идентичность 81% (гомология 93%) с последовательностью цитокератина морского леща 8. После первичной инкубации антител мембраны промывали четыре раза в течение 10 мин каждая в Т- TBS (TBS с 0,1% Tween 20), инкубировали с конъюгированным с HRP козьим анти-кроличьим IgG при разведении 1: 9000 в буфере для антител в течение 2 ч при комнатной температуре и промывали четыре раза по 10 мин каждый в T-TBS. Иммунодетекцию проводили с использованием хемилюминесцентной системы (Western Blotting Luminol Reagent, Santa Cruz Biotechnologies, CA, USA), и изображение на мембране получали с помощью системы VersaDoc Imaging, модель 5000.

Статистический анализ

Количественную оценку относительных уровней белка в электрофорезе 2-DE проводили с использованием программного обеспечения Decyder v.6.5. Статистическую значимость оценивали, используя t- критерий Стьюдента ( p <0,05), применяя коэффициент ложных открытий (FDR), чтобы минимизировать количество ложноположительных результатов. Интенсивность вестерн-блоттинга определяли количественно с помощью программного обеспечения для анализа количества 1 1-D (Bio-Rad) и сравнивали результаты с помощью t- теста Стьюдента. Порог значимости был установлен на уровне р <0,05.

Результаты и обсуждение

Белки слизи кожи в морском леще

В настоящем исследовании была проанализирована слизь кожи морского леща-дрозда, сочетающая протеомные подходы на основе 1-DE и 2-DE MS. Первичным открытием было большое количество белков, которые были идентифицированы с помощью 1-DE, а затем LC-HRMS по сравнению с предыдущими протеомными исследованиями на этом виде рыб, в которых внимание было сосредоточено на наиболее распространенных белках с чрезмерным представлением структурных и связанные с иммунитетом белки. Следовательно, в первой эталонной карте протеома эпидермальной слизи морского леща ( Санахуя и Ибарз, 2015 ), было идентифицировано до 92 белков, и в результате процесса обогащения генной онтологии были получены 12 функциональных групп белков, которые в дальнейшем были классифицированы как структурные, метаболические и связанные с защитой белки. Аналогичным образом, ограниченный набор белков, сгруппированных по структурным (23), метаболическим (25), стресс-ответным белкам (2) и сигнальной трансдукции (2), уже сообщался Jurado et al. (2015) , У лосося атлантического, до 521 белка были идентифицированы и классифицированы в девять основных групп на основе их предполагаемых биологических процессов ( Прован и др., 2013 ). В настоящем исследовании 1595 спектров HRMS были идентифицированы путем сравнения результатов ProteinPilot с базой данных белков Expasy, когда белковый фильтр был установлен на 1,3. Однако, используя нашу базу данных о белке морского леща, мы определили 2466 спектров с гораздо более высоким показателем белка (≥20). Это число было значительно снижено до 2060, когда был применен белковый фильтр 30 (Таблица S1), но даже в этом случае количество идентифицированных белков было относительно высоким по сравнению с белками, которые составляют другие ткани слизистой оболочки и жидкости организма человека ( де Соуза и др., 2006 ; Ли и др., 2009 ; Маримуту и ​​др., 2011 ) и другие модели животных ( Санчес-Хуанес и др., 2013 ; Беннике и др., 2014 ; Винярчик и др., 2015 ). Конечно, этому способствовало использование базы данных по гомологичным белкам, полученной из эталонного транскриптома с высоким охватом кодифицирующих белок последовательностей (более 15 000 уникальных последовательностей в базе данных Swissprot), что впервые повысило согласованность аннотаций параллельно с числом изоформ белка или субъединиц данного фермента или белкового комплекса, представленных в анализируемых образцах (например, ферментные субъединицы дыхательной цепи митохондрий; белковые субъединицы фактора инициации трансляции эукариот; рибосомные белки; субъединицы протеасом и т. д.). В качестве альтернативы, мы не можем исключить различия в видах рыб в отношении оборота эпидермальных клеток, которые могут вызвать усиленный поток белков из кожного эпителия к слою слизи кожи в результате нормальной секреции слизи и / или восстановления тканей и десквамации и обновления клеток , Это, возможно, более распространено, чем первоначально ожидалось, как показывают результаты нашей экспериментальной модели стресса.

Характеристика белка и функции

Среди конечного количества слизистых белков (2060) более 89% (1848 белков) подходили для анализа функциональных путей с использованием программного обеспечения IPA. Эти белки были представлены в 418 канонических путях из 644. Чтобы легко идентифицировать более релевантные пути и биологические процессы, был проведен перекрывающийся анализ с фильтром из шести общих белков среди связанных путей. Благодаря этому интегративному подходу 17 канонических путей со значимыми значениями p ниже, чем 1E-08, были сгруппированы в три отдельных кластера (рисунок 1 ). Первый кластер состоял из 60 белков, включающих канонические пути «окислительное фосфорилирование» и «митохондриальная дисфункция» с высоким представлением энзимных субъединиц дыхательной цепи митохондрий (NADH-дегидрогеназа, комплекс I; сукцинатдегидрогеназа, комплекс II; убихинол-цитохром с) редуктаза, комплекс III, цитохром с оксидаза, комплекс IV, АТФ-синтаза, комплекс V) и гибель митохондриальных клеток и факторы заболевания как с апоптозом (фактор индукции апоптоза 1, каспаза 3), так и с антиапоптозом (пероксиредоксин 3, PRDX3; пероксиредоксин 5; , PRDX5; роли супероксиддисмутазы 2, SOD2; белка Паркинсона 7, PARK7; никастрина, NCSTN) из-за их опосредованного воздействия на клеточный протеолиз, окислительно-восстановительный контроль, дифференцировку и пролиферацию клеток (таблица 1 ).

Рис. 1. Перекрывающаяся сеть канонических путей из белков слизи дрозда морского леща . Это было сгенерировано с использованием инструментов анализа пути развития (IPA). Настройки были выбраны, чтобы гарантировать минимум шесть общих белков между различными каноническими путями. Сплошные линии показывают прямую связь между каноническими путями. Числа, назначенные каждому каноническому пути, представлены в прилагаемой таблице, а числа в скобках указывают количество белков в каждом пути или кластере.

Таблица 1. Белки, картированные в перекрывающихся путях окислительного фосфорилирования и митохондриальной дисфункции .

Как указано Санахуя и Ибарз (2015) До сих пор неясно, связано ли выделение слизи гликолитических или митохондриальных ферментов с активностью клеток Кубка или непосредственно с высокой метаболической активностью в клетках эпителиальных слоев. В любом случае, повышенная гликолитическая активность была отмечена во время эпидермальной инфекции у атлантического лосося ( Прован и др., 2013 ) или родительская забота и вынашивание рта цихлид ( Чонг и др., 2006 ; Ик и Шу-Чен, 2011 ). Между тем, каспаза 1 и 6 были идентифицированы в слизи кожи европейского морского окуня, и было высказано предположение, что секреция этих цистеиновых протеаз активируется по сигналам опасности для усиления воспалительного ответа ( Кордеро и др., 2015 ). Присутствие этих двух каспаз также было обнаружено в настоящем исследовании в дополнение к третьей каспазе, которая была идентифицирована как каспаза 3. Важно, что каскад каспазы 3 активируется проапоптотическими молекулами митохондрий, такими как цитохром с, и сдерживается клеточными ингибиторами белков апоптоза ( Сринивасула и Эшвелл, 2008 ). Действительно, повышенные уровни каспазы 3 в крови пациентов считаются симптомом недавнего инфаркта миокарда ( Агосто и др., 2011 ). Аналогично, PRDX представляют собой семейство антиоксидантных белков с повсеместным и дифференциально регулируемым содержанием в тканях, слизистых оболочках и жидкостях организма ( Лейенс и др., 2003 ; Перкинс и др., 2015 ). В настоящем исследовании до четырех PRDX (PRDX 1, 4, 5 и 6) были обнаружены в слизи кожи морского леща, но только PRDX5 был представлен в митохондриальном кластере после фильтрации по перекрытию канонического пути. Как сообщается ниже, в нашей модели хронического стресса не было обнаружено изменений в количестве PRDX5, хотя следует отметить, что этот митохондриальный PRDX строго регулируется на уровне транскрипции широким спектром пищевых и экологических стрессоров (пищевые масла, высокая плотность выращивания). и паразитарные инфекции) в головной почке дорады морского леща ( Перес-Санчес и др., 2011 ). Кроме того, PARK7 является редокс-чувствительным шапероном, действующим в качестве датчика окислительного стресса, который, по-видимому, защищает нейроны от окислительного стресса и гибели клеток, а дефекты в этом гене являются причиной аутосомно-рецессивного заболевания Паркинсона с ранним началом 7 ( Бонифати и др., 2003 ). Следовательно, присутствие этого белка в слизи кожи морского леща-дрозда можно рассматривать как часть роли антиоксидантной защитной системы в эпителиальных слоях. В этом отношении NCSTN может представлять собой другой важный белок, потому что у людей он играет ключевую роль в хронических воспалительных заболеваниях кожи, влияя на пролиферацию кератиноцитов, контроль клеточного цикла и апоптоз ( Сяо и др., 2016 ).

Второй узел взаимосвязанных белков кожи состоял из 79 белков, участвующих в путях убиквитинирования белков и презентации антигенов, с высоким представлением основных комплексов гистосовместимости, субъединиц протеасом, убиквитиновых ферментов и молекулярных шаперонов, включая калнексин, кальретикулин и белки теплового шока, представляющих шесть основные семейства HSP, основанные на молекулярной массе (маленькие HSP, HSP40, HSP60, HSP70, HSP90 и HSP100) с цитоплазматической, ядерной плазматической мембраной или внеклеточным расположением (таблица 2 ). Это согласуется с наблюдениями, проведенными в предыдущем исследовании протеомного морского леща, в котором было зарегистрировано более 1300 пятен в слизи кожи, но 100 наиболее распространенных были среди других белков, связанных с убиквитином / протеасомой, и HSP ( Санахуя и Ибарз, 2015 ). Кроме того, у атлантической трески сообщалось об изменениях содержания протеасомных белков в ответ на инфекцию V. anguillarum ( Раджан и др., 2013 ) и к проблемам с убитыми формалином Aeromonas salmonicida ( Брикнелл и др., 2006 ). Другим интересным белком в этом кластере был бета-2-микроглобулин, который в настоящее время становится постоянным маркером активации иммунной системы ( Ли и др., 2016 ). Этот небольшой мембранный белок связан с тяжелыми цепями белков главного комплекса гистосовместимости класса I, а концентрации в сыворотке у людей повышены при хроническом воспалении, заболеваниях печени, почечной дисфункции, некоторых острых вирусных инфекциях и ряде злокачественных новообразований, связанных с B-лимфоцитом. родословная ( Drüeke and Massy, ​​2009 ; Ши и др., 2009 ). Однако, насколько нам известно, в предыдущих докладах не рассматривалось наличие и регуляция бета-2-микроглобулина в слизи кожи рыб.

Таблица 2. Белки, картированные в перекрывающихся путях убиквитинирования белка и презентации антигена .

Третий кластер был самым густонаселенным с 257 белками в 13 взаимосвязанных канонических путях (таблица 3 ). Многие из них участвуют в синтезе белка (передача сигналов EIF2, передача сигналов mTOR) и поддержание целостности эпителия (ремоделирование эпителиальных адгезивных соединений, регуляция подвижности на основе актина с помощью Rho, передача сигналов эпителиальных адгезивных соединений и т. Д.), Что также является важным представлением белков острой фазы ответной сигнализации. Этот набор белков включает, среди прочего, альфа-2-HS-гликопротеин, альфа-2-макроглобулин, компонент амилоида Р, аполипопротеин AI, ангиотензиноген, церулоплазмин, компонент комплемента 2, 3, 5 и 9, фактор комплемента B, ферритин, фибриноген, гемопексин, ингибитор интер-альфа-трипсина тяжелой цепи Н2 и Н3, ингибитор серпинпептидазы, транстиретин и трансферрин. О большинстве из них сообщалось в других протеомных исследованиях поверхностей слизистых оболочек, поскольку эти данные согласуются с ключевой ролью иммунитета слизистой оболочки во время большинства инфекций рыб, вероятно, из-за того, что водная среда способствует более тесному контакту с патогенами ( Салинас и др., 2011 ; Эстебан, 2012 ). Мы все еще далеки от полного использования этой информации на регулярной основе, но наше исследование будет способствовать расширению списка иммунно-релевантных белков, которые могут быть включены в массивы белков или более целевые иммунные наборы.

Таблица 3. Белки, картированные в перекрывающихся путях синтеза белка, сборки и ремоделирования клеток и негуморального иммунного ответа .

Белки, регулируемые стрессом

Анализ основных компонентов из обработки изображений 2-DE белков слизи из контрольного CTRL по сравнению с M-ST четко не отделял людей от обеих групп (фигура S1). Таким образом, было обнаружено, что только шесть пятен демонстрируют различную значимую ( p- значение <0,03) численность рыбы, подвергшейся стрессу, с тремя повышенными (с кратным изменением 1,6–2,7) и тремя пониженными (0,6–0,7) белками. Шесть белковых пятен были однозначно идентифицированы путем сравнения данных LC-MS / MS с базой данных транскриптомов морского леща дорады со 100% идентичностью для всех пептидных последовательностей с соответствующим присоединением (таблица 4 ). Пятнами с пониженной регуляцией были фактор удлинения 2 (точка 743; инвентарный номер GenBank KY388506) и цитоплазматический актин (точки 1,549 и 1816; инвентарный номер GenBank KY388507). Пятно 2181 (изменение кратности 1,64) было идентифицировано как митохондриальный белок цитохрома с1 гем (GenBank инвентарный номер KC217621), тогда как два наиболее активированных пятна (пятна 815, 1321) были оба признаны как кератиновый тип II цитоскелета 8 (GenBank инвентарный номер KY388508). Более высокое содержание иммунореактивных белков цитокератина 8 в слизи рыб M-ST было подтверждено вестерн-блоттингом (рис. 2 ), где наиболее распространенной была полоса с более низкой молекулярной массой (38–40 кДа). Цитокератин 8 является сильно модифицированным белком, но наша рабочая гипотеза состоит в том, что эта полоса была протеолитически расщепленной формой. Белковые пятна, представляющие фрагменты кератина типа I или типа II, также были описаны на разных стадиях развития у амфибий ( Доманский и Хелбинг, 2007 ) и личинки атлантической трески ( Свейнсдоттир и др., 2008 ). Аналогично, различные фрагменты цитокератина 8 были обнаружены с помощью иммуноблоттинга в колоректальной биопсии больных раком человека ( Хан и др., 2011 ). Следует отметить, что цитокератин 8 морского леща имеет высокую идентичность (61%) и гомологию (69%) с тем же белком человеческого происхождения, но идентифицированные пептидные последовательности точно соответствуют последовательности белка морского леща, а не человека Таким образом, риск потенциального загрязнения обработки был исключен.

Таблица 4. Белковые пятна, идентифицированные как дифференциально выраженные в слизи кожи морского леща, после множественного сенсорного стресса .

Рис. 2. Относительные уровни белка кератина II типа в цитоскелете в слизи кожи у рыб с множественными сенсорными стрессами (M-ST) и у контрольных рыб без стресса (CTRL) . Значения экспрессии относительно контроля представляют собой среднее ± SEM для восьми индивидуумов. Звездочкой отмечены достоверные различия ( р <0,05, t- критерий Стьюдента) между группами. На вставке показан типичный вестерн-блот с использованием кроличьего антитела против человеческого цитокератина 8.

Явное свидетельство выдающейся механической функции кератинов исходит от множества заболеваний человека и нокаутов мыши. Тем не менее, отдельные кератины являются высоко динамическими каркасами, контролируют трансляцию, пролиферацию, злокачественную трансформацию и вызывают реакции на стресс ( Магин и др., 2007 ; Лошке и др., 2015 ). Важно, что это также относится к рыбе, и различные отчеты показывают, что кератины из слизи кожи обладают антибактериальной активностью благодаря своим порообразующим свойствам ( Molle et al., 2008 ; Раджан и др., 2011 ). Относительно мало известно о точных механизмах, ответственных за сборку и патологию, хотя было высказано предположение, что кератины могут действовать как «фосфатная губка», поглощая активируемые стрессом фосфаткиназы, тем самым снижая их вредное воздействие и защищая клетки от повреждения ( Ку и Омари, 2006 ). Действительно, дифференциальная регуляция фосфорилирования кератина связана со сложными функциональными свойствами определенных типов эпителиальных клеток ( Тао и др., 2006 ; Буш и др., 2012 ; Мажумдар и др., 2012 ). В нашем случае, изменения в содержании цитокератина 8 в слизи кожи морского леща-дрозда поддерживали бы некоторые виды эпителиальных повреждений у рыб, диагностированных как хронически стрессовые, показывая снижение роста и эффективности конверсии корма, усиленную регуляцию маркеров митохондриальной активности. и биогенез в сочетании с высоким вариабельным и незначительным увеличением уровня кортизола в плазме ( Бермехо-Ногалес и др., 2014 ). Поскольку аэробный метаболизм является наиболее важным источником активных форм кислорода (АФК), эта митохондриальная метаболическая характеристика рассматривалась как часть адаптивного ответа на стресс, который уменьшал выработку АФК, когда рыба сталкивается с повышенным риском окислительного стресса в нашей модели стресса, которая имитирует ежедневное выращивание деятельность. Однако величина изменений, наблюдаемых в протеоме слизи кожи, оказалась ниже ожидаемой. Можно утверждать, что этот факт может отражать высокую аллостатическую способность нашего рыбного штамма справляться с хроническим стрессом. Действительно, в других, менее интрузивных моделях хронического стресса, рыбу интенсивно преследовали в течение 5 минут 2 раза в день после понижения уровня воды, и данные о параметрах роста свидетельствовали о реальной адаптации к стрессу с переходом от аэробного к более анаэробному метаболизму без изменений в кортизоле плазмы. уровни ( Бермехо-Ногалес и др., 2014 ). Кроме того, другие факторы, включая время года, возраст и фон питания, должны рассматриваться комплексно, чтобы в конечном итоге понять степень, в которой протеом слизи кожи морского леща регулируется стрессовыми факторами окружающей среды и питания, помогая понять, насколько стрессовое состояние может быть хорошим оценивается на уровне фермы, не вызывая дальнейшего стресса.

Выводы

Протеомный подход на основе масс-спектрометрии с высоким разрешением позволил идентифицировать 2062 белка в слизи кожи леща дорады после сопоставления в базе данных гомологичных белков. Три основных кластера с более чем 350 белками были сохранены после фильтрации путем перекрывания канонического пути. Среди них были широко представлены белки окислительного фосфорилирования, дисфункции митохондрий, убиквитинирования белков, иммунного ответа, ремоделирования эпителия и сборки клеток. Это было подкреплено наблюдением, что основные изменения, связанные с обилием цитокератина 8 в слизи кожи стрессовых рыб в нашей экспериментальной модели хронического стресса, были обнаружены с помощью методологии 2-DE и подтверждены иммуноблоттингом. Вся эта информация будет полезна при разработке более целенаправленных подходов, направленных на конкретные изменения протеома слизи кожи рыб, выращиваемых на ферме, с особым акцентом на маркеры оборота эпителиальных клеток кожи.

Вклад автора

JP, RO и AS разработали и разработали исследование. OF надзор за обработкой животных и отбор проб. JP, GT, PS, SR и JC выполнили идентификацию белка и функциональную характеристику белка слизи и белков, регулируемых стрессом. JP и PS провели Вестерн-блот анализ. JP, GT, AS и JC написали рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

финансирование

Это исследование финансировалось проектом Европейского Союза (AQUAEXCEL, FP7 / 2007/2013; грантовое соглашение № 262336, «Аквакультурная инфраструктура для передового опыта в исследованиях европейских рыб»). Мнения, выраженные в этой работе, являются исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражают взгляды Европейской комиссии. Дополнительное финансирование было получено от испанского министра экономики и конкуренции (MI2-Fish, AGL2013-48560) и от генералитета Valenciana (PROMETEO FASE II-2014/085). Исследование протеомики проводилось в лаборатории протеомики Университета Валенсии, Испания (SCSIE). Эта лаборатория является членом Protected, PRB2-ISCIII и поддерживается грантом PT13 / 0001 из PE I + D + i 2013–2016, финансируемым Instituto de Salud Carlos III и Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что это может привести к возникновению конфликта интересов.

Дополнительный материал

Дополнительный материал для этой статьи можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphys.2017.00034/full#supplementary-material

Рекомендации

Похожие

Комментарии